李兰娟团队:新冠突变影响致病性 感染差异达270倍

                       
目前关于新冠病毒（SARS-CoV-2）的基因组调查数据表明，病毒存在着大量的单核苷酸变异(SNVs)，此前尚无研究表明突变与病毒致病性的功能改变直接相关。

然而，李兰娟院士团队的最新研究提出了直接证据，证明目前发生在新冠病毒基因组中的突变具有影响病毒致病性的功能潜力。李兰娟团队提示：疫苗和药物的开发需要考虑到这些累积突变，尤其是始祖突变的影响，以避免潜在的缺陷。

在最新的一份研究中，来自浙江大学的研究团队报告了11例新冠患者来源的病毒分离株的功能特征，它们都至少有一个突变。重要的是，当感染Vero-E6细胞时，这些病毒分离株在细胞病变效应和病毒载量方面表现出显著差异，差异高达270倍。

当地时间4月19日，浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室、浙江大学生命科学研究院、浙江省胰腺病研究重点实验室的研究团队在医学预印本平台medRxiv在线发表了一篇研究论文“Patient-derivedmutations impact pathogenicity ofSARS-CoV-2”。该论文通讯作者为中国工程院院士、国家卫健委高级别专家组成员李兰娟教授，浙江大学生命科学研究院研究员蒋超，浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室吴南屏教授和郑敏教授。



目前的研究认为，跨膜刺突糖蛋白（S蛋白）介导病毒进入宿主细胞，S蛋白根据蛋白结构功能又被分为两个功能单位，即S1和S2蛋白亚基。其中S1负责与宿主细胞受体结合，S2负责病毒和细胞膜融合。新冠病毒和SARS-CoV都使用血管紧张素转换酶2（ACE2）进入靶细胞。ACE2在人鼻上皮细胞和肺、精原细胞、间质细胞、支持细胞、胃、十二指肠和直肠上皮细胞中表达。

论文提到，S蛋白的受体结合域（RBD）是β冠状病毒中最具变异性的基因组部分，S蛋白的某些位点可能会受到正向选择。不过，尽管新冠病毒具有大量的变异性，一个关键的问题仍然是：这些突变是否对新冠病毒的致病性有任何真正的功能影响？

研究人员认为，上述问题对理解病毒感染机制至关重要，并指导药物和疫苗的开发战略，为应对疫情大流行下一阶段做准备。为了解决这一问题，研究人员从浙江大学附属第一医院收治的患者中分离出11株新冠病毒毒株。

研究人员在Novaseq6000平台上对11株病毒分离株进行超深度测序，发现病毒分离株的编码序列分别存在1-5个突变，同样也观察到混合群体（代表病毒准种，Quasi-species）。他们总共鉴定出33个突变（包括在混合群体中观察到的10个突变），根据与GISAID在2020年3月24日提供的1111个基因组序列的比较，其中19个是新的突变。

研究人员还用11株病毒分离株感染了Vero-E6细胞，并定量评估了它们在感染后（P.I.）1、2、4、8、24和48小时的病毒载量，以及在感染后48和72小时的病毒性细胞病理效应（CPE）。

他们的研究结果表明，在感染Vero-E6细胞时，观察到的突变会对病毒载量和细胞病理效应产生直接影响，差异最高达270倍。这一发现表明，研究中观察到的病毒突变，可以显著影响新冠病毒的致病性，而这种突变在全球各地采集的病毒毒株中都可能存在。

总体而言，这项研究提供了直接证据，证明目前发生在新冠病毒基因组中的突变具有影响病毒致病性的功能潜力。研究人员提醒，除了不断积累的基因组测序数据外，还应尽可能在细胞水平上进行病毒监测。最后，与流感类似，药物和疫苗的开发虽然紧迫，但也需要考虑到这些累积突变，尤其是始祖突变的影响，以避免潜在的缺陷。

<strong style="font-weight:700">患者流行病学病史

本研究中涉及的11例患者的样本收集于国内疫情暴发的早期阶段，时间为2020年1月22日至2020年2月4日。



11例患者中有10例与武汉有明确关系，这11人中有5人确诊前在武汉工作或旅行，另外5人与居住在武汉的人有过密切接触，剩下的1人与新冠患者有过接触。值得注意的是，患者ZJU-4、ZJU-5、ZJU-9均参加了有武汉同事出席的同一个商务会议。

因此，根据这11例患者的流行病学历史，他们构成了第一代和第二代感染病例。

11例患者中男性8例，女性3例，年龄4个月至71岁不等。除1例患者外，其余所有患者均有中度或更严重的症状，3例有合并症，1例需要ICU治疗。

截至该论文撰写，所有病人均已康复。

<strong style="font-weight:700">11例患者中采集的病毒分离株中存在多种突变

为了评估这11株病毒分离株的突变谱，研究人员在Illumina Novaseq6000平台上对分离的病毒基因组RNA进行了超深度测序，平均每个样本产生2.45亿个读数/67.16 Gb。

他们总共鉴定出33个突变（包括在混合群体中观察到的10个突变），根据与GISAID在2020年3月24日提供的1111个基因组序列的比较，其中19个是新的突变。



具体来说，在ZJU-1中发现了G11083T和G26144T，这两种突变都被认为是一个大群体病毒的始祖突变。ZJU-2和ZJU-8中发现了C8782T和T28144C突变，这两种突变被认为是另外一个大群体病毒分离株的始祖突变。

ZJU-2、ZJU-5、ZJU-9、ZJU-10和ZJU-11这5个病毒分离株中均发现了T22303G突变，ZJU-5和ZJU-9在一次商业会议中暴露于相同的潜在感染源。值得一提的是，此前仅在澳大利亚分离得到的病毒株中鉴定出具有T22303G突变。

值得注意的是，和ZJU-5、ZJU-9参加同一会议的患者ZJU-4的病毒分离株有一个新的突变A22301C，它在蛋白水平上（S蛋白中的S247R）导致了与T22303G相同的错义突变。

最后，ZJU-11在ORF7b基因中有4个突变，其中3个是连续的，并在蛋白水平上引入了2个突变。

值得注意的是，研究人员认为，尽管GISAID中的序列数据对跟踪病毒的个体间变异非常有帮助，但我们仍然对病毒的个体内进化动力学知之甚少。例如，在ZJU-4和ZJU-10中，两个独立位点的等位基因频率分布非常相似，这表明这两个位点可能是相关联的，提示在病毒种群中至少存在两种单倍型。

总的来说，尽管在这项研究中只分析了11株来自病人的病毒株，研究人员仍观察到突变多样性，包括目前在全球传播的不同主要病毒簇的几种基本突变。这种多样性的突变谱与它们相对较早的采样时间和相对接近武汉市是一致的。不过，由于样本量有限，武汉地区早期病毒的完全变异多样性至今仍不清楚。

研究人员讨论指出，在11个病毒分离株中发现了多种突变，包括目前感染全球人口的两大类病毒的两组始祖突变。此外，尽管取样日期相对较早，31个已鉴定的突变中有19个是新的，这表明病毒株的真正多样性在很大程度上仍未得到充分认识。

另外，T22303G突变在5个病毒株中均观察到，这个特定的突变在早期疫情中已经出现，并可能在相当数量的武汉人身上都有。这可能是由于突变的始祖效应，在这种效应情况下，T22303G突变在早期并没有从中国传播出去。

值得注意的是，ZJU-11的三核苷酸突变是出人意料的。研究人员注意到，这个特殊的病毒分离株在研究中的病毒载量和CPE测定中都显得非常“强有力”，其来源病人也非常罕见地持续45天新冠阳性，最近从医院出院。

他们认为，研究这种三核苷酸突变的功能影响将是非常有趣的。值得注意的是，在目前的数据库中，另一个三核苷酸突变（G28881A,G2882A和G28883C）已被鉴定出，也导致了两个蛋白水平的错义突变。

研究人员还提醒一点，与最近报道的不能从粪便样本中获得活病毒相反，这项研究中有3个病毒分离株是从粪便样本中提取的，研究表明新冠病毒能够在粪便样本中可以复制。

<strong style="font-weight:700">系统发育分析揭示不同的进化史

为了从已有的新冠病毒测序数据中了解11株病毒分离株的系统发育背景，研究人员从GISAID（下载于2020年3月21日）获得了725个高质量、高覆盖的新冠病毒基因组，其中包括2013年在云南中华菊头蝠中采集的RaTG13病毒株和广东穿山甲病毒株作为外群。

研究人员构建了一个包含736个病毒序列的最大似然系统发育树，得到的系统发育树与GISAID上更新的系统发育分析基本一致。

研究观察到相当多的始祖突变。具体来说，在这项系统发育分析中，研究人员注意到以下三个最大的簇：第一、在231个病毒序列中发现三个核苷酸突变C241T、C14408T和A23403G（S-D614G簇），大部分在欧洲分离获得；第二、在208个病毒序列中发现两个核苷酸突变C8782T和T28144C（ORF8-L84S簇），在这项分析中它们不是单源的(图2A和图S3)。然而，在ORF8-L84S簇内的92个基因组序列上可以观察到明显的单源亚支（subclade），主要由来自美国西雅图的病毒序列组成（ORF8-L84S-USA-WA-clade）；第三、在34个病毒序列中发现两个核苷酸突变G11083T(ORF1a中的L3606F)和G26144T (ORF3a中的G251V)，其中大部分来自荷兰和英国。

研究人员提到，还可以观察到几个由不同的始祖突变集定义的较小的单源簇。例如：第一、31个病毒序列发现了G1937A(ORF1a中的V378I)突变；第二、12个病毒序列中发现了G1440A和G2891A突变，导致了ORF1a基因的G392D和A876T突变，大部分来自德国或荷兰；第三、8个基因组序列中发现了C15325T和C29303T突变，导致了N基因的P344S突变，来自中国或日本。



研究人员将11株病毒分离株整合到系统发育分析中，它们分散在整个系统发育空间中。ZJU-1与ORF1a-L3606F和ORF3a-G251V组聚类，它同时具有这两种典型的突变。另一方面，ZJU-2与ZJU-8和ORF8-L84S聚类，它们都有两个始祖突变。由于上述T22303G突变，ZJU-9和ZJU-11与澳大利亚的一个分离株聚类。其他毒株则或者突变较少，或者没有与任何已知的大规模群体聚集的新突变，这反映了这11个样本的广泛多样性。

综上所述，研究人员认为，一些单源病毒群确实表现出明显的地理模式（特别是欧洲和美国），但这可能是由于在大流行初期发生各自突变的“始祖效应”。

<strong style="font-weight:700">感染Vero-E6细胞时，病毒拷贝数和细胞病理效应有显著差异

目前来看，COVID-19患者表现出多种临床症状，流行病学研究表明，临床结果受个体年龄、并发症和其他潜在未知参数的严重影响。为了检测患者来源的新冠病毒分离株的突变影响，研究人员进行了体外感染试验。



研究人员首先检测了病毒分离株是否能如预期那样成功地与Vero-E6细胞结合，并以S蛋白形成的标志性“皇冠”来直观识别病毒颗粒。然后，他们用所有11个病人来源的病毒分离株感染Vero-E6细胞，并在感染后1、2、4、8、24和48小时收集细胞。在48小时和72小时时分别取细胞的DIC显微照片来评估CPE。



他们使用针对ORF1a、E和N基因的特异性实时转录聚合酶链反应(RT-PCR)来检测新冠病毒的存在。循环阈值Ct用于量化病毒载量，较低的值表示较高的病毒载量。由于这三个基因的结果高度一致，他们只讨论ORF1a基因的结果。



简要来说，所有病毒分离株样本感染后1、2、4小时的Ct值保持平稳，仅有小的波动。在这些较早的时间点上，病毒粒子结合入侵细胞，病毒复制在这个阶段很少发生。

在感染后8小时，研究人员观察到ZJU-6、ZJU-7、ZJU-9、ZJU-10和ZJU-11的Ct值显著下降，即意味着病毒载量增加。感染后24小时，观察到除了ZJU-2和ZJU-7外，所有病毒分离株的Ct值都显著下降，其中一些病毒分离株，即ZJU-10和ZJU-11，下降速度比其他病毒快得多。感染后48小时，除ZJU-10和ZJU-11外，所有病毒分离株均有小幅度下降，研究人员推测ZJU-10和ZJU-11在24小时时均已趋于稳定。



值得注意的是，感染后24小时，ORF-8-L84S簇成员ZJU-2和ZJU-8（大部分来自美国华盛顿州西雅图）的病毒载量显著降低。另一方面，与S-D614G分支(主要在欧洲发现)同簇的ZJU-1病毒载量是ZJU-2和ZJU-8的19倍。此外，在感染后24小时，ZJU-10和ZJU-2的病毒载量相差近270倍。

论文提到，这些差异在48小时变得有统计学意义，在分析基因E和N的数据时是可重复的。因此，研究人员认为，不同的病毒分离株在感染Vero-E6细胞时表现出显著的病毒载量变化，这是由其基因组的不同突变决定的。



接下来，研究人员检验了病毒载量增加是否会导致更多细胞死亡。在感染后48小时和72小时显微镜下观察这些细胞系，CPE或细胞死亡率与病毒载量数据高度一致，表明病毒载量越高，细胞死亡率越高。

他们在讨论环节提到，由于患者表现出的临床症状极为多样，在患者中建立基因型与表型的联系将是非常困难的。体外细胞系提供了一个理想的系统，以检查不同的分离病毒株突变的影响。

他们认为，虽然Vero-E6细胞系并非来源于人，但Vero-E6细胞系的ACE2蛋白与人的ACE2蛋白高度相似，直接证明了新冠病毒可以感染该细胞系。