中国科学家颠覆长寿基因认知 提出胎儿期死亡新解释

　　1999年，科学家在最简单的真核生物酿酒酵母中发现了具有延长寿命的Sir2基因。此后，在小鼠等啮齿类动物中，Sir2的同源基因SIRT6同样被发现有此魔力。自此，SIRT6被科学界奉为经典的“长寿基因”，成为人类掌控衰老速度的一个热门突破口。

　　北京时间8月23日凌晨，中国科学院干细胞与再生创新研究院等研究团队在国际顶级学术期刊《自然》（Nature）刊发历时3年的一项最新的合作研究成果：首次实现SIRT6在非人灵长类动物中的全身敲除，获得了世界上首例特定长寿基因敲除的食蟹猴模型。



　　非人灵长类作为人类的“表亲”，在基础科研和医学研究中具有其他模式生物无可比拟的优势。国家杰出青年基金获得者、干细胞国家重大科学研究计划首席科学家、中科院生物物理所研究员刘光慧是该项成果的通讯作者之一，他在接受澎湃新闻（www.thepaper.cn）采访时表示，“关于SIRT6这个长寿基因在包括人在内的灵长类中所起的作用，例如是否可以调节衰老，此前由于研究手段的限制使得人们无法回答这个问题。”

　　有趣的是，这项初衷为解析长寿基因如何调节食蟹猴衰老的研究，最终却颠覆了此前对长寿基因的传统认知。一直致力于通过研究人类加速衰老疾病的机制来解决诸多老龄化问题的刘光慧等人，这次的注意力从生命终端被拉到了生命的起点：经典“长寿基因”的缺失居然导致食蟹猴在子宫内发育不良并出现出生后早夭。

　　首次在非人灵长类猴子身上得到的这一结论，让刘光慧等格外兴奋。“此前在啮齿类等动物中看到的一些“加速衰老的症状”可能并不完全是“衰老”的表型；根据基于食蟹猴的研究结果，SIRT6在胚胎发育早期的缺失可能更多的是延迟了机体的发育。SIRT6缺乏小鼠可能也具有发育迟缓的表型，但可能由于啮齿类和灵长类动物具有较大的种属差异，例如，小鼠具有更长的端粒等，所以SIRT6敲除的小鼠可以在出生后存活4周甚至更长的时间。”

　　值得注意的是，SIRT6导致食蟹猴子宫内发育迟缓这一点，目前在人类中也有了蛛丝马迹。

　　就在刘光慧等人的论文发表前不久，美国有研究团队在《基因与发育》（Genes & Development）发文，该研究团队通过筛查流产胎儿发现，在人类SIRT6基因上的功能突变也会引起胎儿子宫内生长发育迟缓，最终在晚期引起胎儿死亡。

　　刘光慧表示，“这实际上同我们在猴子身上看到结果非常类似，很好地佐证了我们的结论。” SIRT6敲除猴子模型或可以为人类围产期致死综合征的发病机理提供新的研究途径。

　　除刘光慧之外，该研究的通讯作者还包括中科院动物研究所李伟研究员和胡宝洋研究员。中科院生物物理研究所张维绮研究员，中科院动物研究所万海峰助理研究员、冯桂海副研究员和曲静研究员为共同第一作者。中国干细胞与生殖研究领域权威、中科院动物研究所研究员、中科院院士周琪也参与并指导了此项研究。

　　让食蟹猴丧失长寿基因

　　Sirtuin蛋白家族本质上是一类从酵母到人类高度保守的去乙酰化酶，其备受关注源于和人类孜孜以求的长寿扯上了关系。

　　除酿酒酵母之外，线虫、果蝇，直至到更高等一点的小鼠，科学家均发现有Sir2的同源基因存在。而在哺乳动物细胞里，目前已知的Sir2同源基因有7个，即SIRT1至SIRT7。

　　相信红酒有助长寿的人或许对SIRT1并不陌生。有研究者认为，红酒中包含的白藜芦醇（Reseratrol）能够通过激活SIRT1来使得哺乳动物寿命延长。2008年，英国制药巨头葛兰素史克（GSK）还付出7亿多美元购得SIRT1药物开发的一项技术。尽管如此，白藜芦醇的作用机制和疗效在科学界还存在着一定的争议。

　　相比于SIRT1，人们认为SIRT6在衰老和寿命调控中同样具有重要的作用。SIRT6敲除小鼠寿命会缩短，表现出加速衰老的特点，例如皮下脂肪缺失，脊柱弯曲、骨量减少、端粒缩短等。人们相信，SIRT6对于哺乳动物来说是一个经典的‘长寿蛋白”，具有调控机体衰老的作用。

　　刘光慧表示，“目前人们广泛应用的SIRT6敲除小鼠早衰模型具有重要的科学价值，不仅可以用于研究啮齿类动物衰老的规律，而且人们可以利用这个模型进行药物筛选和评价。具有延长早衰小鼠寿命活性的化合物可能对于人类衰老性疾病的防治具有提示和借鉴意义。”

　　然而，受限于基因编辑技术等原因，SIRT6这一重要的调控衰老的开关此前从未在猴子或人类身上被科学家随意开启或关闭。此前在2016年，刘光慧团队仅在人类间充质干细胞中通过基因编辑敲除SIRT6，并观察到SIRT6的缺失确实能够导致人干细胞稳态失衡。

　　“高效、彻底地在猴子体内敲除特定基因的技术难度非常大，迄今为止还没有敲除任何衰老和长寿基因的报道。”论文共同通讯作者李伟研究员提到，“需要在胚胎发育早期运用非常高效的CRISPR技术，这样才能干净地敲掉SIRT6基因，使之后产生的机体的所有细胞都不再有这个基因。”


基因敲除食蟹猴产生示意图。

　　

而在此番研究中，李伟和刘光慧等人借助高效CRISPR?Cas9基因编辑技术最终成功获得SIRT6全身敲除的食蟹猴。

　　研究团队共制备98个食蟹猴受精卵， 其中48个发育、形态学正常的基因敲除胚胎被移植到12只代孕猴子中。有4只代孕猴子受孕成功，其中3只完成了大约165天的怀孕周期，每只均生下一只小母猴。另一只在怀孕中期流产了一只公猴。

　　“早产儿”仅存活数小时

　　按照实验计划，研究团队将会花上比在小鼠等模式动物身上多得多的时间来观察食蟹猴的“早衰”。毕竟，如果一只猴子的寿命能达到20余年，乐观一点的话，研究团队希望在猴子出生后的1年至数年后能观察到加速衰老的迹象。

　　不过，这些实验预期在SIRT6基因敲除食蟹猴出生后的数小时后即被完全打破节奏。

　　论文中提到，SIRT6敲除猴子出生时明显偏小，体重比野生型新生猴子约轻3.5倍，相当于这些野生型新生猴子在2-4个月胎龄时的大小。

　　“寿命只有几个小时，这些刚出生的SIRT6敲除的猴子非常小，发育速度几乎减慢了一倍，但它们还是足月生产出来了。这些“早产”的猴子在出生后是不能很好存活的，各器官组织都远没有达到可以在母体外存活的成熟度。”李伟表示。

　　也就是说，SIRT6敲除导致食蟹猴在子宫内出现了全身发育迟缓，导致类似“早产”而无法在出生后生存。


出生大小、体重差异比较。

　　

论文共同通讯作者胡宝洋提到，“我们检测了SIRT6敲除的所有食蟹猴，在基因组和表观基因组水平都没有发现任何“加速衰老”的特征，相反看到了更加不成熟的发育早期状态。而皮下脂肪减少，骨密度减少，肠上皮受损等在SIRT6敲除小鼠中被认为是加速衰老的特征，我们在SIRT6敲除食蟹猴身上同样也看到了。不过，2-4个月胎龄的野生型猴子也具有类似的表型，说明这些未必是衰老的特征。”

　　胡宝洋认为，或许科学家们在小鼠身上看到的相关异常并不完全是加速衰老， SIRT6在食蟹猴中的缺失阻滞了器官的发育，发育的时钟被拨回到胎儿期的特定阶段。“我们在猴子里观察到的许多现象与小鼠都不太一致。”

　　此外，同新生的野生型猴子相比，SIRT6敲除食蟹猴的脑更小，大脑和小脑半球的皮质层更薄，类似于野生型猴的胎儿。研究团队认为，基于这些数据，SIRT6可能是食蟹猴脑发育过程中神经干细胞分化的关键调控开关，SIRT6的缺失会推迟神经元的成熟。

　　研究团队随后在分子机制层面解释已有的结论。他们比较了SIRT6敲除食蟹猴和野生型新生猴子7种器官中全基因组RNA的表达，鉴定出至少在一种器官中，两者存在着多达11001个基因表达的差异。其中在至少四种器官中，有1026个基因表达存在差异。

　　而在所有存在表达量差异的基因中，长链非编码核糖核酸 H19（最早被鉴定出的印迹基因之一，印记基因被认为与发育和很多疾病相关）上调最为明显，在SIRT6敲除食蟹猴脑部的表达量是野生型新生猴子的27.5倍。

　　而此前有研究已经得出结论，H19表达在胚胎发育过程中对包括大脑在内的各组织发育具有非常关键的作用。

　　在人类中会如何？

　　在猴模型中，敲除经典“长寿基因”SIRT6带来了颠覆性的新认知，那如果进一步延伸到人类，结果又会如何？人类的“表亲”是否帮助准确预演了结果？

　　在研究衰老调控的同时长期研究干细胞的刘光慧想到的是对人类干细胞“动刀”。研究团队采用TALEN基因编辑技术获得SIRT6敲除的人类胚胎干细胞，在细胞培养皿中进而将这种万能的“种子细胞”诱导分化成神经前体细胞。

　　“我们利用现有的成熟的研究平台，可以通过对人的干细胞进行基因组编辑，进而研究定蛋白对人类干细胞或终末分化细胞稳态的影响。”刘光慧提到，和众多致力于建立非人灵长类疾病模型的团队不同，他们更关注于将食蟹猴研究中发现的生物学规律在人类干细胞中体系加以深入进一步研究和验证。

　　研究团队在人类神经干细胞中得到了和在SIRT6敲除食蟹猴脑中类似的结论。SIRT6敲除的神经前体细胞表现出神经元分化的延迟，研究人员未能在显微镜下看到成片连接的特征性神经元网络。进一步发现，SIRT6敲除的人类神经细胞中也具有较高的H19转录本水平。


人类干细胞神经分化比较。

　　

接下来的问题是，如果要疏通所谓的“通路”，研究团队必须还要回答SIRT6是否直接控制H19表达？研究团队最终发现，受SIRT6调控的乙酰化组蛋白H3K56ac（组蛋白H3第56位赖氨酸残基乙酰化修饰）在其中是中间一环。

　　正常情况下，SIRT6能结合到H19上游的印记调控区，SIRT6作为一种组蛋白去乙酰化酶可以使得组蛋白去乙酰化，从而导致H19转录沉默。由此在神经分化的过程中，H19转录水平并不会特别高，神经分化程序保持正常。

　　研究团队称，这也就意味着，SIRT6可以通过介导H19印记调控区的组蛋白去乙酰化来反式抑制H19的表达。

　　然而，在 SIRT6敲除的人类神经前体细胞模型中，看到的一个结果就是SIRT6的缺乏使得H3K56ac增多，同时还伴随有更多的H19转录的反式激活因子CTCF。这些因素都导致H19升高，从而抑制神经分化。

　　实际上，在SIRT6敲除食蟹猴中同样观察到，H3K56ac在多种组织中均增加。和上述结论一致的是，SIRT6敲除食蟹猴中H19的表达因此而大幅增加。


SIRT6-H3K56ac-H19通路。

　　

SIRT6-H3K56ac-H19这条通路在实验室条件下的人类干细胞模型中被拼接完整。而在人体中，这条通路实际上也在若隐若现。

　　此前有研究证明，H19在人体中过量表达被证明和银罗素综合征（SRS）相关。银罗素综合征又称先天侏儒症，发病率只有十万分之一，它的特点即是严重的子宫内和出生后生长发育迟缓。

　　同样有力的一点是，2018年3月，《基因与发育》发表美国科研团队的一项成果显示，人类中SIRT6的功能突变（D63H）会引起胎儿子宫内生长发育迟缓，最终在晚期引起胎儿死亡。

　　刘光慧表示，“该研究团队主要通过筛查流产的胎儿，发现有某些胎儿携带有SIRT6单点突变，而突变位点刚好是去乙酰化酶的活性位点，他们看到的包括神经系统发育迟缓等表型，实际上跟我们在食蟹猴中看到的很类似，非常好地佐证了我们的发现。”

　　刘光慧认为，研究团队建立了一个全新的人类出生前发育迟缓（围产期致死）综合征的研究体系。“SIRT6作为表观遗传因子可以调节灵长类动物的出生前发育，而在临床上，我们的发现有助于深入理解因子宫内发育迟缓而导致胎儿流产或新生儿死亡的分子基础。接下来更为重要的科学问题是，在临床上有多少胎儿发育迟缓的病例与SIRT6基因的突变有关，我们如何发展有效的生物医学手段进行干预和治疗？”