体外培养胚胎时间延长至两周:揭开早期发育关键过程

　　来源：Nature自然科研

　　新技术带来的不仅是关于人体发育的突破性见解，还有日益凸显的伦理问题。

　　时间拉回到2013年年中让人高度紧张的两周，英国剑桥大学发育生物学家Magdalena Zernicka-Goetz正在赶超一项世界纪录――她和同事尝试在实验室里进行有史以来最长的人体胚胎培养，试图摸索出这一小团细胞何以发育成一个复杂的多部位结构。

　　之前的研究都在持续一周后就中止了，但Zernicka-Goetz深知，一周后的人体发育还有很多值得深究之处。

　　研究人员最初使用的胚胎来自那些不再需要接受体外受精的女性所捐赠的。研究团队将之前小鼠胚胎的培养方式稍加调整，先把细胞浸泡在特殊的培养基里，再放入培养箱中。由于胚胎样本必须处于严格受控的环境中，研究人员每天只能移动一到两次样本，在显微镜下跟踪它们的发育情况。


Toby Leigh

　　时间到了第六天、第七天、第八天。胚胎仍在顽强发育着。Zernicka-Goetz回忆道，“我们几乎都屏住了呼吸，一天比一天激动。”研究团队首次尝试就坚持了12天，并最终达到13天。她说：“一切都难以置信。我高兴坏了。”

　　与之前来自纽约的一支团队一样，Zernicka-Goetz团队的成果也是过去五年来推动早期人体发育研究的为数不多的亮点之一。由于人体胚胎来源有限，研究人员对胚胎早期发育知之甚少。

　　好在细胞培养方法不断改进，如今体外培养人体胚胎的时间已能延长至两周。科学家使用CRISPR等基因编辑技术，构建人造“胚胎样”结构，用来研究促进形成胚胎以及胚胎支持组织的细胞信号和作用力。

　　这些技术有助于阐明胚胎早期发育的关键过程，如胚胎植入――极小的胚胎一旦植入子宫内膜，就难以对它进行直接研究。全新高分辨率数字图像让发育后几周里的肌肉和神经生长一目了然。这些发现能让研究人员更好地找到出生缺陷、发育障碍、甚至是流产的原因。

　　新技术带来了新希望，但也把研究人员推入了未知的伦理境地。伦理学家和科学家在上世纪70年代末达成了“14天规则” ，要求人体胚胎研究必须在受精后的14天内结束――14天是神经系统逐步成形的第一天，也是胚胎分裂的最后一天。

　　到目前为止，国际公认的14天规则一直是一个纯假设的限制。位于纽约的黑斯廷斯中心（Hastings Center）的生物伦理学家Josephine Johnston表示，“并没有人违反这个规则，但如今，要突破这个限制从技术上说是可行的。”

　　胚胎发育

　　动物界许多物种的早期发育过程都惊人地相似，只是一些基因或信号稍有不同。在哺乳动物中，科学家对小鼠发育的分子作用机制研究得最为透彻，通过让基因逐个失效来确定它们的功能。实验所需的小鼠数量一般很易获得，而且小鼠与人类的早期细胞类型和细胞组分较相似，小鼠胚胎因此成了人体胚胎发育研究的适当替代选择。

　　不过，研究人员也开始怀疑这种相似性究竟能达到什么程度。加拿大多伦多儿童医院的发育生物学家Janet Rossant表示，“随着人们踏入人体早期发育研究的大门，人们也越来越认识到小鼠胚胎和人体胚胎虽然相似，但并不一样。”


插图来源：Nik Spencer； 图片来源：Norah Fogarty、Kathy Niakan

　　由于人体组织来源有限，科学家只能通过高效的基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）来辅助探索胚胎的早期发育。又因为围绕胚胎遗传修饰的伦理争议不断，迄今为止，只有少部分研究团队获准开展这方面的研究。

　　来自伦敦弗朗西斯?克里克研究所（Francis Crick Institute）的发育生物学家Kathy Niakan团队率先获得了监管当局的批准。2017年，Niakan团队报告了如何使用CRISPR-Cas9技术对一个同时在人体和小鼠胚胎干细胞中表达的基因进行编辑。

　　敲除该基因后，人体胚胎会缺少一种名为OCT4的蛋白，导致胚胎无法发育成囊胚――囊胚中大约有200个细胞。相比之下，同样敲除该基因的小鼠胚胎却能发育成囊胚，之后逐渐萎缩。

　　这种差异呼应了一种越来越受到认同的观点――即使在发育早期，一些具体的遗传信息可能只对人类才有意义，如特定基因何时被激活等。

　　Niakan表示，“我们知道大多数体外受精的胚胎无法发育至囊胚阶段”，虽然个中原因尚不明确，但“明确胚胎里第一类细胞的形成通路有助于改善体外受精技术。”Niakan希望接下来可以研究那些引导一小部分囊胚细胞形成胚体的人体基因，而不是形成胎盘等支持组织的基因。

　　成功着床

　　发育成含200个细胞的囊胚后，小囊胚必须在子宫内膜着床才能继续存活。一旦埋入子宫内膜（约第七天时），科学家基本无法继续研究囊胚的发育。第一个挑战就是如何观察整个植入过程。从前，研究人员尚无可靠手段让胚胎发育时间超过一周。

　　如今，这个黑匣子终于被科学家打开。在2016年5月发表的两篇论文中，Zernicka-Goetz团队和纽约洛克菲勒大学的Ali Brivanlou团队首次报告了能让人体胚胎培养至12-13天的系统。

　　研究人员指出，只要以正确比例混合生长因子和营养物质，培养皿中的人体胚胎就能“植入”培养皿底部。尤其值得注意的是，胚胎植入后无需母体组织就能触发早期重组步骤。Brivanlou回忆道，“当时我惊呆了，我原本认为人体胚胎在植入后根本无法存活超过一两天。”

　　植入培养皿的胚胎比真实的胚胎要扁。（Brivanlou把植入过程比作降落伞着陆。）但这一胚胎培养着实打破了好几项纪录，超过之前动物实验和通过流产等渠道获得的人体组织样本的有限研究的预期。

　　在最新的实验中，胚胎在植入培养皿底部后，细胞外层开始分化成早期胎盘和其他类型的细胞，用于支持胚胎发育。细胞内部也发育出胚体和卵黄囊前体，这是向胚胎输送血液的早期结构。在快到14天时，两个团队都遵守14天规则，结束了实验。

　　当时，一些胚胎已经停止了发育。不过研究人员表示，随着技术的进展，这些培养系统将有助于揭示更多关于胚胎最初两周的细节。


　　图画来源：Nik Spencer； 图片来源：Magdalena Zernicka-Goetz团队（顶部）； Martynet al。（底部）

　　好几个关键事件都会在第三周的原肠胚形成阶段完成。从这时起，胚胎发育出体轴，其中一端会慢慢发育成头部。随后，细胞开始迁移分化，形成三胚层，三胚层最终形成身体全部的组织和器官（见上图“步步成长”）。这一过程非常重要，也是伦理天数限制在14天的主要原因。

　　一些研究人员开始寻找替代方法，通过人体干细胞技术打造合成胚胎样结构，就可以不受14天规则的限制。不过，这种胚胎缺少一些完全发育所必需的成分，植入后也无法发育成人类。

　　2014年，洛克菲勒大学的Brivanlou、Eric Siggia和同事报道了他们运用专门培养的人体胚胎干细胞来模拟体外原肠胚形成过程。他们发现，一旦限制干细胞只能在直径几百微米的圆形培养皿中生长，干细胞会分化成“靶心”图样，其中包含的三类主要细胞会逐步发育成身体各部位。

　　从扁形虫到灵长目，在几乎所有动物中，这三类细胞都具有类似功能：中心的细胞成为皮肤、大脑和神经系统；外面一圈发育成肌肉、血液、骨骼和各种器官；最外圈的成为消化道和呼吸系统。

　　扁平的环状看上去并不像真实人体胚胎的立体交叉三维结构。但在细胞和分子水平上，这种结构完全符合研究人员的预期。Siggia实验室前博士后研究员Aryeh Warmflash说：“这个系统让我们可以更好地剖析信号通路和细胞结局之间的关系。”


　　该胚状体中的信号波会促进细胞分化。红、黄色表示信号很强，蓝色表示信号较弱。来源：Idse Heemskerk、Aryeh Warmflas（莱斯大学）

　　对这一系统的跟踪研究揭示了胚胎细胞如何通过几何和化学方法自组织成不同类型的组织。2016年，Brivanlou、Siggia和他们的团队证实，干细胞可以感知自己在这个圆形空间中的位置，并相应调整对生长因子的响应方式，这有助于形成离散的细胞区域。

　　在2017年预印本服务器bioRxiv发布的一篇研究中，来自美国德州莱斯大学的Warmflash团队证实，生长因子的动态也起到了作用；研究人员发现特定蛋白组会使信号传导增强（统称为Nodal信号通路），并从外向内呈波浪式扩散，最终形成不同类型的细胞。

　　Brivanlou团队对这一体系做了更进一步的研究。今年5月，研究人员利用混合生长因子，诱导形成了“组织者”细胞。这些特殊细胞能在动物体内引导周围细胞形成从头到尾的体轴。不过，14天规则在一定程度上限制了科学家，使他们无法见证人体组织者细胞的活动。

　　面对人体胚胎研究的伦理和技术的双重限制，Brivanlou只能把假定的人体组织者细胞群嫁接到发育中的鸡胚胎上，并观察嫁接的细胞群如何引导鸡细胞发育出第二套鸡神经系统。

　　生命保障

　　虽然大多数有关人体早期发育的研究都集中在胚胎本身，但许多其它组织对胚胎的存活也至关重要，比如包裹胚胎的羊膜囊和输送氧气及营养素的胎盘。

　　为了更好地了解羊膜囊的发育过程，研究人员用人体干细胞创造了一个模型。去年，美国密歇根大学安娜堡分校的发育生物学家Deborah Gumucio、生物工程师Jianping Fu及其同事在凝胶中培养人体干细胞，并在周围搭建天然分子支架。

　　研究人员发现，细胞会自组织成类似羊膜囊的团状物。大约24小时后，细胞团上打开了一个孔，慢慢地，细胞的一端逐渐变平，另一端逐渐拉长――这些都是原肠胚形成前的特征。

　　虽然这个模型只复制了胚胎核和胎囊，其它支持胚胎存活的组织并不存在，但研究人员仍能识别出帮助形成这种不对称结构的分子信号。Gumucio说：“可以挖掘的有用信息太多了，完全没必要进一步打造出更完整的胚胎模型。”科学家让胚胎样培养物保持到第5天时（约对应9-14天的发育时长），就中止了实验。

　　Zernicka-Goetz团队尝试培养出更完整的胚胎结构。2017年，他们联合培养了两类小鼠干细胞，一类是形成胚胎本身的细胞，一类是帮助胎盘形成的细胞，也叫滋养层干细胞。把这种合成结构放置在三维支架中，合成结构会在植入后发育成类似胚胎的结构。研究人员正在尝试通过人体干细胞创建类似的胚胎样结构，这有助于进一步了解胚胎组织和胎盘等胚胎外组织间的相互作用。

　　一些实验室不断开发出越来越精密的合成模型（被称为“胚状体”），伦理问题也逐渐浮出水面。美国杰克逊实验室（Jackson Laboratory）的干细胞生物学家Martin Pera表示，“我认为这是片灰色地带。我们要如何评价这些发育中的结构？”

　　许多伦理学家和科学家一致认为目前的合成胚状体过于简化，不适用于14天规则。但美国凯斯西储大学的生物伦理学家Insoo Hyun认为，很难确定哪些特征会让胚状体更加贴近现实。“构建超过14天、在植入子宫后能继续发育的模型是完全有可能的。”

　　身体构造

　　研究人员在破解后期发育阶段方面也取得了不小的进展，而大部分进展得益于组织染色和成像技术的提高。在2016年《科学》发表的一份报告中，阿姆斯特丹大学学术医学中心的研究人员将卡内基科学研究院（Carnegie Institution for Science）保存的15000 个各类组织的切片进行了数字化处理。

　　这些组织切片是从流产、手术和尸检中获得的样本，时间跨度从19世纪80年代一直到20世纪上半叶。这项研究以最初两个月内的发育过程为对象，通过数字化手段，利用单个切片追踪了近150个器官的轮廓，再把切片对齐，对原始胚胎进行三维模型重建，制作成交互式图谱。

　　高分辨率胚胎研究已经贡献出不少发现。例如，人们总是认为发育过程中肾脏会向上生长而生殖腺会向下生长，但是该团队发现，这其实是因为它们与椎骨的生长速度不同，导致它们看起来在向上或向下。

　　不过，卡内基这些切片的一大限制在于缺少分子标记物，因此很难识别出不同类型的细胞。为了弥补这一缺陷，法国国家健康与医学研究院（INSERM）的Alain Chédotal在2017年发布了包含36个发育时间为6-14周的人体胚胎和胎儿的全新三维图谱。Chédotal团队采用组织透明法处理这些捐赠样本，使之更易于在显微镜下成像，另外采用染色方法标记不同细胞类型。


　　左右手的神经发育遵循不同的分支模式。　来源：Alain Chédotal/Morgane Belle/Fondation Voir et Entendre

　　最后的高分辨率三维图像清晰地展现了神经、肌肉、肺部和其它器官的发育过程。美国霍华德大学医学院的Rui Diogo从事四肢肌肉发育的数据集挖掘工作，他说：“就细节来看，超过之前所有的效果。”

　　在Diogo团队尚未发表的结果中，研究人员还发现了一些会随发育逐渐消失或融合手部和脚部肌肉。Diogo说：“当我们还是胚胎时，我们有一些成年以后没有的肌肉。” 除了这一意外发现，Chédotal也指出，虽然左右手的总体神经组织很类似，但在最初的7周到11周里，两只手的细微分支模式遵循不同的生长路径。

　　发展领域

　　随着技术的不断改进，科学家希望可以更深入地理解人体发育，揭示出导致流产和出生缺陷的原因。

　　对胚胎早期发育的进一步关注也引发了更加激烈的伦理争论。Zernicka-Goetz和 Brivanlou的延时实验让重新权衡“14天规则”利弊的声音再次出现。

　　5月，莱斯大学贝克健康与生物科学研究所举办的一场会议邀请了30位美国科学家、伦理学家和其他领域专家，共同探讨是否应该以及如何调整14天规则，Brivanlou和Johnston也参加了此次会议。

　　与会专家Hyun说：“我认为14天规则应该保留，同时允许特殊情况下请愿破例。”

　　随着这方面的研究结果不断涌现，技术进步让科学家既欣喜又不安。Johnston认为两种情绪都值得重视，“惊奇和敬畏交织，让我们无时不谨记这是人类最初的样子，让我们无刻不警醒这不是普通细胞而已。我想，这也是很多道德顾虑的来源。”