60万美元买来的仪器3年过气怎么办？看你会不会改造

　　来源：Nature自然科研

　　过时的基因组测序仪不一定非得淘汰不用，研究人员可以稍加改造，让它们在下一代生物化学研究中发挥余热。

　　在斯坦福大学的一个地下储藏室里，十几台DNA测序仪被拆解开来，价值数十万美元的摄像头、激光器以及光学和流体控制器散落在地，它们都来自名为GAIIx的Illumina第二代DNA测序仪。地板上，一台旧仪器只剩一个空壳。“感觉自己像一个囤积狂。”斯坦福大学生物物理学家William Greenleaf说。


这个下一代生物化学平台被称为“宁静号”，由一台旧Illumina测序仪的元件组装而成。

　　Greenleaf的实验室有18名成员，因为这些旧仪器，其中约有一半的人在过去6年里都投入进了一项特别的工作当中。大多数研究人员使用DNA测序仪都是为了测序，但Greenleaf团队却属于少数那一派，他们把这些设备改造一番后用于截然不同的用途，即大规模研究蛋白质和核酸生物化学，比如大分子的相互作用、RNA折叠和酶功能。

　　“这是一项革命性的技术。”斯坦福大学的生物化学家Dan Herschlag说。他利用该技术研究RNA和其它分子之间的相互作用，它可以提供“深入而广泛的定量信息”，“使研究人员能够建立更精确的生物物理和细胞模型来研究分子间的相互作用，这也是真正对生物系统进行预测理解的关键一步”。

　　从广义上讲，这项工作证明了当科学家深入研究硬件核心时，会创造出更多的可能性，也证明了陈旧或过时的设备不一定就没有价值。

　　但是这种技术发展被形容成“出血边缘”（bleeding edge）也不无道理，因为常常会出现错误。生物物理学家Sarah Denny今年刚从Greenleaf实验室毕业，在被问及她的设备是否能够“即插即用”时，她笑了。她说：“做实验的时候经常有东西坏掉，你必须把它修好才能继续。”但考虑到她能够提取的数据量，这样的代价是值得的。就Denny而言，她的团队对RNA折叠有了更深入的理解，这就是自己动手的得与失。

　　芯片上的生物物理研究

　　2008年，GAIIx横空出世，成为一时的热门产品。一些测序中心有几十台GAIIx，每台约60万美元；一台机器在一周时间内，就能完成300亿个DNA碱基的测序。

　　但到了2011年，Greenleaf在斯坦福建立他的实验室时，这个行业已被更快的硬件占领，比如Illumina HiSeq 2000。新一代测序仪更高效，对用户也更友好，因此旧测序仪就这样被弃之不用了。“它们基本上都变成了没用的大块头。”Greenleaf说。

　　Illumina测序仪通过合成过程自动测序。DNA文库被随机排列在一个叫做“流动池”的装置上，然后通过扩增形成大约1000个分子的小簇，每个代表一个遗传信息片段。然后，DNA的组成（核苷酸）被转移到芯片上，每个芯片都包含特有的荧光标记和可逆的化学修饰。

　　此过程保证了在每个簇上只能添加一个核苷酸。然后，测序仪对结果进行成像，并根据每个位置的颜色，“识别”或“读取”添加的碱基。之后修饰被移除，再重复整个过程，通过识别一个个碱基最终获得完整序列。

　　这些仪器的核心是高端显微镜和液体处理器，用以帮助移动试剂。其中一些组件，特别是摄像头、激光器和移动台，可能要花费数万美元。2009年，麻省理工学院的RNA生物学家Christopher Burge意识到，或许可以通过改造这些硬件来做其它的研究。

　　改造的基础

　　Burge表示：“GAII本质上是一个泵系统，它将物质泵到流动池中，然后再泵到一个高级成像系统中。因此我们意识到，或许它也可以把其它的东西泵到流动池中。”

　　这是因为GAIIx系统是一个“开放系统”，它通过可编辑的配置文件（recipes）进行控制，并且装载了一些方便替换的试剂。机器内部同样是开放的，由现成的第三方组件组装而成。生物化学家Gary Schroth是加州Illumina公司基因组应用小组的负责人，他与Burge合作进行了早期研究，他表示：“现在想想，这好像是在高中进行的科学小组研究。”

　　相比之下，新的Illumina仪器更精细，并且采用定制硬件、硬线控制软件和条形码标记试剂，这些功能可以改善用户体验，但是也妨碍了改造。

　　Jacob Tome在康奈尔大学分子生物学家 John Lis的实验室做研究生时，帮助改造了一个GAIIx。他回忆起与Illumina公司代表打过的 “许多个紧张的电话”，只为解决公司的仪器控制软件难题。由于没有现成的仪器重编程手册，因此解决问题在很大程度上依赖于反复试错。

　　Tome说：“我博士生涯中最令人兴奋的一个星期是我们坐在测序仪前，通过自己编写的配置文件，观察温度上升，观察仪器在抽取什么溶液。”


测序仪流动池的荧光图像揭示了特定簇的结合反应。

　　不过，好在Burge得到了帮助。他的团队与Schroth合作，修改了GAIIx配置文件以接受新的试剂，引入暂停功能，调整运行温度并改变成像参数。随后，研究人员利用该改良系统对酵母中一种名为Gcn4p的DNA结合蛋白的测序偏好进行了全面研究。

　　“我们首次证明可以把测序仪变成一种生物物理仪器，从而以极高的通量测量蛋白质-DNA的相互作用。”Burge说。

　　为此，Burge的团队对通常在测序后便丢弃的流动池进行了处理，以便在每个簇中再生双链DNA。然后，他们将荧光标记的Gcn4p蛋白引入芯片，逐渐升高蛋白浓度，并且通过修改后的软件，让测序仪对流动池进行成像处理，就仿佛它刚刚完成了另一轮测序。

　　通过下载和处理最终的图像，而非通常输出的碱基信息，团队可以测量每个位置结合了多少Gcn4p，据此推断出它对芯片上每条序列的亲和力，总共获得约4.4亿个测量值。

　　“这是一个非常迷人且精妙的实验。”Greenleaf说。它表明GAIIx平台有潜力执行他所感兴趣的所有测量，包括动力学测量、结合率、解离率和平衡常数，以及所有有助于从根本上理解DNA-蛋白质互作的物理测量。

　　一些研究人员使用类似的方法来解决他们自己的问题。例如，麻省理工学院的RNA生物学家David Bartel以信使RNA（mRNA）为研究对象，他的研究团队发现，在mRNA分子末端的多聚腺苷酸尾“A”碱基数目与动物发育过程中基因产生蛋白质的效率存在关联。

　　德克萨斯大学奥斯汀分校的生物物理学家Ilya Finkelstein改造了一个测序仪流动池，用以研究一种名为Cascade的蛋白质的DNA结合偏好。这种蛋白质被用在某一版本的基因编辑技术CRISPR?Cas中。Greenleaf团队的一些成员与CRISPR的研究先驱、加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna合作，研究了为什么CRISPR中最常用的酶Cas9有时会在错误的DNA位置进行剪切。

　　研究人员还研究出了通过转录芯片上的DNA来创建超高通量的RNA阵列的方法，这种方法可以用来研究RNA -蛋白质的相互作用，或者用来筛选被称为适配子的折叠RNA分子文库。

　　要获得这样一个阵列，挑战在于如何捕获转录RNA。Lis和Greenleaf分别在双链DNA分子末端引入了物理块，使RNA聚合酶（产生mRNA分子的酶）和它的转录本停滞不前。在纽约威尔康奈尔医学院，RNA生物学家Samie Jaffrey所在团队（由化学生物学家Nina Svensen领导，那时她在实验室做博后）利用一种特殊的病毒RNA聚合酶将新合成的RNA连接到芯片，然后添加了核酸酶来降解模板DNA。

　　针对某种疾病进行改造

　　对于斯坦福的生物物理学家Rhiju Das来说，这样的RNA阵列已经成为一种识别可用于诊断活动性结核病分子的平台。该项目源于一位同事发现了三种可区分潜伏结核和活动性结核的RNA标记。

　　他们面临的挑战是精确定位 “核糖开关”分子――实际上可以识别疾病的状态。这样的诊断分子必须能够结合所有的三个RNA，外加一个荧光标记，并根据所存在的RNA改变形状。“很明显，这些条件让人崩溃。”Das表示。

　　为了解决这个难题，Das为他联合开发的一款在线游戏eterna招募了一群玩家。玩家的任务是设计出能够以特定方式折叠的RNA；最有希望的结构被合成为DNA测序库的一部分，每次10000个，并在GAIIx芯片上进行测试。每个设计有1万个测量值，这就意味着每个实验中大约有1亿个数据点，这些数据会反馈给玩家以提高他们的技能。

　　Das说，随着时间的推移，一些用户变得相当熟练。“玩家现在已经发现了背后的基本原理，因此能够得到完美的核糖开关――热力学上最优，适用于各种测试。”

　　另外还有一项OpenTB挑战赛（OpenTB Challenge）。在3轮游戏中，Das的团队测试了187名玩家的近2.7万个核糖开关，鉴定出了几个似乎符合要求的开关。其中一个是由马萨诸塞州一位退休工程师提交的，它在一种状态下看起来像一个城堡的平面图，而在另一种状态下则像一个锚。现在，在盖茨基金会的资助下，Das计划开始测试其中部分设计是否能用于像检测怀孕一样来检测结核病。

　　与此同时，一些科学家已经进入到下一步：将芯片上的RNA翻译成蛋白质。2016年，Svensen表明她可以利用抗生素嘌呤霉素将肽固定在表面，从而在阵列上合成被称为多肽的短蛋白序列。

　　今年6月，Greenleaf实验室的博士后Curtis Layton报道开发了一种名为“大规模并行阵列蛋白质展示”（Protein display on a Massively Parallel Array）的方法，分析了SNAP-tag酶的156，140种变体。他想了解氨基酸序列与蛋白质功能之间微妙的关系。他表示：“能够在这些机器上进行全新的蛋白质功能分析，真是太令人兴奋了。”

　　但是，这些令人兴奋的工作并不容易：Layton花了四五年时间开发他的方法和硬件。Svensen花了两年的时间开发出了自己的方法――现在被Jaffrey的实验室用来创建一个全人类蛋白质组芯片。

　　她表示：“那时候给GAII买一个测序试剂盒需要5000美元。如果每一次实验都得花这么多钱，那么你很难进行太多轮的优化。”因此，目前在英国邓迪大学威康抗感染研究中心工作的Svensen主要在显微镜载玻片上做测试，或者使用本部门核心设施的废弃流动池。

　　改造历程

　　大多数GAIIx改造者使用的机器基本上保持了原样，仅通过调整仪器软件完成他们想做的。按照Jaffrey的说法，这使得任何一个身边放着一台GAIIx的人都可以使用它。“我们不想要只有工程师才能使用的东西，任何研究人员都可以利用这台仪器开展我们的实验。”

　　Greenleaf实验室早期利用GAIIx进行的RNA研究也没有什么不同。Layton表示，这个系统是由斯坦福大学的遗传学家Patrick Brown捐赠，为了纪念《星球大战》中的“千年隼号”飞船而命名的，飞行员Han Solo曾对这艘飞船发出呼喊：“听到了吗？坚持住！”

　　Layton说：“这是一台旧机器，但是我们努力开发一些新用途，我们希望它不要有任何错误，不要带来任何问题。但是，当它真正工作的时候，错误还是发生了。没有人能这样获取数据。”

　　最终，团队认定这种方法不可持续。Layton表示，不同于现在的按键界面的测序仪，GAIIx更像“阿波罗飞船”，而不是“千年隼号”。而新一代测序仪速度更快，读长更长。此外，Illumina公司在2015年宣布将“终结”GAIIx，也就是说从2017年7月起不再提供相关流动池、试剂和部件。

　　团队提取了该系统的光学器件、载物台、相机、泵系统和激光器；用可以向下进行广域照明的系统补充了测序仪内嵌的从下方以锐角照亮样品的原有照明系统；设计了一种新的印刷电路板来操作激光器；从GAIIx部件中取出一个自动进样器，使添加试剂的过程自动化；另外还增加了机载温度控制器。

　　最重要的是，这个团队设计了新的样品支架，使GAIIx成像系统可以容纳Illumina公司更小的新型MiSeq芯片。Greenleaf说：“这样一来，我们能够将荧光和测序的生物物理测量分开。”（Finkelstein同样采用MiSeq芯片开展实验，然后利用传统显微镜成像。）

　　这样得到的装置令工程师倍感欣慰：一个紧凑的黑色立方体，表面看起来像是一台被扯开的台式电脑。Layton表示，最困难的部分是编写控制硬件所需的软件，并确定什么信号驱动什么动作。“这是一次艰难的探索。”他说。但总的来说，这个项目满足了他对工程和软件设计的业余兴趣，更不用说生物化学了。

　　Winston Becker是该实验室的一名医学生，拥有双博士学位和工程力学硕士学位。出于类似的原因，他被吸引到这个项目中来。“我想做一些偏物理和定量方面的研究。很明显，能有机会运用仪器技术，制作仪器，是一件让人兴奋的事。”

　　但是，直接买一台显微镜岂不是更简单？根据Greenleaf的说法，这一选项并不存在，或者至少不是能够负担的选择。“真的没有什么现成可用的设备，”他说，“没有任何设备能完成我们想做的事情。”他估计，定制一台仪器可能要花费数十万美元。

　　Das在Greenleaf实验室的协助下，依据Greenleaf的设计制造出了自己的仪器，他说这次经历“非常有趣”。但他表示，由于没有操作指南，“你要不怕去烦扰别人”。

　　尽管如此，仍可能出现一些棘手的问题，比如Das的仪器无法正确聚焦。经过两周的故障诊断，Das意识到缺失了一个镜头。他说：“这太愚蠢了。”此后，他编写了一本64页的说明书。宾夕法尼亚州斯沃斯莫尔学院的Nick Kaplinsky也发表了一篇详细的博客评论，描述了他将GAIIx转化为一种用于植物根系成像的显微镜（RootScope）的相关工作。

　　按照以虚构的星际飞船命名仪器的传统，Das将他的仪器命名为“红矮星号”，取自一个英国科幻系列小说；这个团队随后又增加了一艘姊妹船――“诺斯特罗莫号”（取自《异形》）。

　　Greenleaf的其他仪器包括“黄金之心”（《银河系漫游指南》）、“博格方块”（《星际迷航：下一代》）和“宁静号”（《萤火虫》）。“如果你建造了一台仪器，你就会得到为它命名的荣耀。”Greenleaf说。他的实验室实际上有十几台测序仪，它们散落在楼里，处于不同的分解状态，其中大部分只花了运费而已。

　　如果一切按计划进行，这支“舰队”将成为Greenleaf工作中不可或缺的一部分。他的实验室最出名的可能要属开发出了ATAC-seq――一种评估与蛋白质结合的染色质的可接近性的方法，实验室一半的人力都投入进了这项工作中。现在，Greenleaf希望合并这些团队，利用他改造后的测序仪构建数学模型，准确地反映细胞内部的大分子互作。

　　那么其他研究人员会效仿吗？Schroth表示，由于涉及到试剂、硬件和分析工具，这些分析方法自定义程度较高，很难在其他实验室中复制，尤其是在没有专业人员帮助的情况下。

　　但是改造者提出了一个简单的解决办法：开放现代平台进行探索。Burge说：“这样一来，科学界就可以开发出一些新用途，让每个人都受益。”Finkelstein也表示：“淘汰的测序仪有很大的再利用空间，只要你愿意去做。”